Dowody naukowe

/Dowody naukowe
Dowody naukowe2018-11-06T18:09:07+00:00

BADANIE EX VIVO WPŁYWU PREPARATÓW ANOXIDENT BALANCE® NA REDUKCJĘ POZIOMU GLUKOZY W ŚLINIE OSÓB Z CUKRZYCĄ

Mme Françoise Bafort – Liège University – Agro-Biotech-Passage des Déportés 2 – 5030 Gembloux – Belgium. Presented at the Opening Symposium of the Brussels Diabetes Research Pole, Free University of Brussels, 26th February 2016

Abstrakt

U pacjentów cukrzycowych higiena jamy ustnej jest mocno utrudniona ze względu na ciągłe wahania poziomu cukru w ślinie – zdecydowanie częściej występuje próchnica zębów, w szczególności próchnica korzeni zębowych, oraz choroby dziąseł i przyzębia. W badaniu wykazano, że jest możliwe przeciwdziałanie występowaniu nadmiernych wzrostów stężenia glukozy w ślinie diabetyków. Produkt wykazujący tego typu działanie może pomóc w rozwiązaniu wielu problemów związanych z jamą ustną, z jakimi borykają się diabetycy, takich jak: zapalenie dziąseł i przyzębia, ból, infekcje, utrata zębów, zaawansowana próchnica zębów i wiele innych.

Wstęp

Do najczęściej występujących chorób i dolegliwości jamy ustnej u pacjentów cukrzycowych należą:

  • zapalenie dziąseł
  • zapalenie przyzębia
  • nasilenie występowania zmian próchnicowych
  • zespół piekących ust
  • ból i pieczenie języka (wraz z zanikiem brodawek nitkowatych i grzybowatych)
  • zakażenie Candida (kandydoza)
  • suchość jamy ustnej (kserostomia)
  • zaburzone czucie smaku
  • zaburzony proces wyrzynania zębów i mineralizacji szkliwa
  • przerost ślinianki przyusznej
  • owrzodzenia błon śluzowych.

Lekarze oraz pacjenci powinni być świadomi zmian, jakie zachodzą w jamie ustnej u osób z cukrzycą. Ważna jest kontrola stanu jamy ustnej natychmiast po zdiagnozowaniu cukrzycy u pacjenta. Dentyści powinni być świadomi, na jakie choroby jamy ustnej narażeni są pacjenci cukrzycowi i w jaki sposób można je leczyć oraz w jaki sposób im zapobiegać.

W tym badaniu ex-vivo wyjaśniono, w jaki sposób można zredukować ryzyko wystąpienia najpowszechniejszych u cukrzyków chorób jamy ustnej: chorób dziąseł i przyzębia, oraz próchnicy zębów.

W badaniu wykorzystano opatentowany Kompleks Protein MPE™, zastosowany w produktach do higieny jamy ustnej ANOXIDENT balance®. Kompleks MPE™ znacząco obniżył stężenie glukozy w ślinie diabetyków, co w rezultacie prowadzi do obniżenia ryzyka wystąpienia próchnicy zębów i chorób dziąseł.

Metody

  1. Heksokinaza

    Zastosowano metodę, w ramach której przeprowadzona została:

    • analiza stężenia glukozy w ślinie osób z cukrzycą przed zastosowaniem Kompleksu Protein MPE™
    • analiza stężenia glukozy w ślinie osób z cukrzycą po zastosowaniu Kompleksu Protein MPE™.

     

    Do ustalenia dokładnego stężenia glukozy w ślinie lub innym roztworze stosuje się enzym heksokinazę wg poniższej reakcji:

    przy użyciu heksokinazy
    Glukoza + ATP glukozo-6-fosforan + ADP

     

    przy użyciu G6PD (*)
    Glukozo-6-fosforan + NADP+ 6-fosfo-glukonolakton + NADPH + H+

    (*) G6PD: glukozo-6-fosfodehydrogenaza

    Standardowy roztwór glukozy

    Przygotowano standardowy (wzorcowy) roztwór 1000μM glukozy. Z tego wyjściowego roztworu przygotowane zostały rozcieńczenia 10-krotne z buforem zawierającym: 100mM HEPES, 12mM MgCl2, 120mM KCl i 20mM KH2PO4 – przy pH 7,5 otrzymanym przy użyciu 1M NaOH.

    Otrzymano roztwory o różnym stężeniu glukozy, od 5 do 500μM i te roztwory poddane zostały następującej analizie:

    100 μl roztworu glukozy zmieszano z 95 μl reagentu zawierającego 2.0 mM MgCl2, 0.5 mM ATP, 0.5 mM NADP+ i 0.06 jednostek dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z drożdży, w buforze TRIS-HCL (200 mM, pH 8,1). Dokonano pierwszego pomiaru absorbancji przy długości fali 340nm. Następnie zapoczątkowano reakcję przez dodanie 5 μl heksokinazy do reagentu (0.06 jednostek). Absorbancję odczytywano co 1 minutę przez 5 minut w pokojowej temperaturze. Roztwory z dodatkiem heksokinazy wymieszano przez odwrócenie kuwet. Absorbancja została zmierzona po 30-minutowej inkubacji roztworów w temperaturze pokojowej. Analiza została przeprowadzona na różnych roztworach glukozy (w stężeniu od 5 do 500 μM), przygotowanych z roztworu wyjściowego (standardowego).

    Obliczenia

    Zastosowano metodę punktów końcowych. Wysokość plateau jest proporcjonalna do stężenia glukozy w roztworze.

    Początek wykresu ustalono przez zmierzenie absorbancji próbki kontrolnej (roztworu nie zawierającego heksokinazy). Wyniki wszystkich pomiarów przedstawiono w μ-molach/l, wykres przedstawia krzywą stężenia glukozy w próbkach (5-500 μM).

    Figure 1: Standard curve of the determination of the glucose concentration in function of the of the NADPH production using the hexokinase method

  2. Kompleks Protein MPE™

    MPE™ to kompleks protein, enzym, który jest zdolny do przekształcenia w obecności ATP alfa-D-glukozy w alfa-D-glukozo-6-fosforan i ADP.

    MPE
    D-glukoza + ATP (*) α-D-glukozo-6-fosforan + ADP

    (*) ATP obecne w Kompleksie MPE™ pochodzi z miceli kazeinowych występujących w surowym mleku.

    Glukoza w środowisku obojętnym (pH 7) występuje w formie cyklicznej pod postacią 36,4% beta-D-glukozy i 63,6% alfa-D-glukozy. Cukry występują głównie w formie pierścieniowej – zawartość formy łańcuchowej w stanie równowagi jest znikoma i w przypadku glukozy wynosi jedynie ok. 0,02%. Utworzenie formy pierścieniowej powoduje powstanie nowego centrum chiralnego i co za tym idzie dwóch diastereoizomerycznych odmian formy pierścieniowej – anomerów α i β. W roztworze cukru ustala się stan równowagi pomiędzy formami α, β i łańcuchową, będącą stanem pośrednim w procesie przemiany jednego anomeru w drugi.

    Rozpuszczając zatem kryształy cukru uzyskanego w czystej formie α lub β (jest to możliwe poprzez krystalizację w odpowiednich warunkach), po pewnym czasie uzyska się roztwór, w którym obecne będą wszystkie formy w stanie równowagi, w odpowiednich proporcjach zależnych od budowy chemicznej danego cukru. Przemianom tym towarzyszy zmiana kąta skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Natychmiast po sporządzeniu roztworu wartość skręcalności właściwej jest charakterystyczna dla czystego anomeru. Z czasem skręcalność zmienia się aż do momentu osiągnięcia stanu równowagi, kiedy odpowiada wypadkowej skręcalności obu form anomerycznych znajdujących się w stanie równowagi. Zmiana skręcalności właściwej roztworu cukru spowodowana ustalaniem się równowagi pomiędzy formami α i β w roztworze w wyniku zmiany konfiguracji przy anomerycznym atomie węgla nosi nazwę mutarotacji.

    Reakcja utlenienia alfa-D-glukozy zmienia równowagę między ilością alfa- i beta-D-glukozy, w związku z czym następuje przekształcenie beta-D-glukozy w alfa-D-glukozę:

    α-D-glukoza β-D-glukoza

     

    MPE™ katalizuje reakcję transformacji alfa-D-glukozy w alfa-D-glukozo-6-fosforan. Reakcja ta może być mierzona ilością powstałego NADPH w obecności NADP+ i alfa-D-glukozo-6-fosfodehydrogenazy.

    W opisanych w dokumencie eksperymentach naukowych stężenie glukozy w badanych roztworach zostało zmierzone metodą z wykorzystaniem heksokinazy.

    Ocena stężenia glukozy w roztworze po zainicjowaniu reakcji z MPE™

    1. Inkubacja 1ml roztworu zawierającego 500μM glukozy i 2 mg MPE™ w 37°C przez 120 sekund.
    2. Przeniesienie roztworu do kąpieli wodnej 80°C (temperatura denaturacji białek MPE™) w celu przerwania reakcji.
    3. 100μl tej mieszaniny zostaje pobrane w celu zbadania jaka ilość glukozy pozostała po reakcji z MPE™ (wykorzystano metodę z heksokinazą).

    .

  3. Próbki śliny

    Próbki śliny zostały pobrane przy pomocy wacika bawełnianego do standaryzowanego pojemnika (próbówki) z dwoma przegrodami. W górnej części pojemnika (do którego wprowadzano bawełniany wacik) znajdował się otwór, dzięki któremu po odwirowaniu ślina zbierała się w dolnej części pojemnika i stąd mogła być pobierana do dalszej analizy.

    Przygotowanie próbek śliny do badania ex-vivo:

    1. 2x płukanie jamy ustnej wodą w objętości 150ml
    2. Trzymanie w jamie ustnej bawełnianego wacika przez 2 minuty (stymulując przez żucie wydzielanie śliny lub nie stymulując jej wydzielania).
    3. Przeniesienie wacika nasączonego śliną do górnej części pojemnika.
    4. Ilość (w ml) śliny oznaczono ważąc próbówkę z suchym wacikiem, a następnie z wacikiem nasączonym śliną, przyjmując, że 1g śliny odpowiada 1 ml.
    5. Wirowanie próbek (2000 ob/min przez 5 minut), dzięki czemu frakcja śliny zawieszonej w bawełnianym waciku zbiera się w dolnej części próbówki.
    6. Podzielenie próbek śliny na dwie części: jedna część stanowi kontrolę, druga będzie badana w reakcji z MPE™.

     

    Materiały

    Próbówki do badania śliny – Salivette, Numbrecht, Niemcy.

    HEPES – Gibco; MgCl2 – Merck; KCl – Merck; KH2PO4 – Merck; NADP+, G6PD, ATP – Merck; Heksokinaza (180mU/essay)- Sigma

    MPE™ – opracowane i dostarczone przez Taradon Laboratory. Jest to mieszanka białek pozyskanych z surowego mleka przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych i chromatografii jonowymiennej.

    Wyniki

    Początkowo przeprowadzono badanie w celu określenia właściwości MPE™. Ważne jest, że MPE™ ma powinowactwo do przekształcania tylko alfa-D-glukozy, nie reaguje z innymi węglowodanami zawartymi w pożywieniu, takimi jak laktoza czy fruktoza. To samo dotyczy skrobi.

    Zostało wyznaczone optymalne pH dla najwyższej aktywności MPE™, które wynosi od 5.5 do 7, czyli jest zbliżone do tego występującego w jamie ustnej. Optymalna temperatura dla działania enzymu to 37 – 40°C, która także jest zbliżona do temperatury śliny.

    Następnie zbadano, w jaki sposób wpływa MPE™ w roztworze na obecność glukozy
    w różnych stężeniach. Na poniższym wykresie widać, że w czasie krótszym niż dwie minuty możliwe jest wyeliminowanie całej glukozy obecnej w 500 μM roztworze glukozy.

    Figure 2: Elimination of a standard glucose solution (500 µM/l) by the MPE

    Drugą część badania przeprowadzono na 6 pacjentach z cukrzycą i 3 osobach zdrowych.

    U osób zdrowych stężenie glukozy w ślinie wynosiło średnio:

    • 4 μM (normalne wydzielanie śliny)
    • 3 μM (stymulowane wydzielanie śliny)

    .
    U diabetyków stężenie glukozy w ślinie wynosiło średnio:

    • 264 μM (normalne wydzielanie śliny)
    • 255 μM (stymulowane wydzielanie śliny)

    .
    Badanie zostało przeprowadzone w celu sprawdzenia, czy Kompleks MPE™ zawarty w preparatach Anoxident balance jest w stanie znacząco zredukować ilość glukozy w ślinie.

    Do badania pobrano ślinę od pacjentów i zainicjowano reakcję z MPE™. Reakcja została zatrzymana po 30, 60 i 120 sekundach.

    Wykorzystując metodę analityczną z wykorzystaniem heksokinazy, przeanalizowano stężenie glukozy pozostałe po reakcji z MPE™. Rezultaty przedstawiono w poniższej tabeli:

    Osoby zdrowe Osoby z cukrzycą Stężenie glukozy (osoby zdrowe) Stężenie glukozy (osoby z cukrzycą)
    30 sec. 60 sec. 120 sec. 30 sec. 60 sec. 120 sec.
    Stężenie glukozy (µM) µmole/l µmole/l µmole/l µmole/l µmole/l µmole/l
    Ślina niestymulowana 68.4 +/- 7.4 264 +/- 10.5
    Ślina stymulowana 34.3 +/- 8.6 255 +/- 11.3
    Produkcja śliny (ml/min)
    Ślina niestymulowana 0.96 +/- 0.11 1.27 +/- 0.12
    Ślina stymulowana 1.92 +/- 0.12 1.48 +/- 0.11
    Wydzielanie glukozy (nmol/2min)
    Ślina niestymulowana 134.2 +/- 6.8 670.8 +/- 0.12 67 53.58 40.26 254.904 127.452 67.08
    Ślina stymulowana 131.6 +/- 13 755.4 +/- 0.11 65.8 52.64 39.48 287.052 143.525 75.54


    Tabela 1: Spadek stężenia glukozy u osób zdrowych i osób z cukrzycą po zastosowaniu Kompleksu protein MPE po upływie 30, 60 i 120 sekund

Analizując tabelę wyników, można zaobserwować:

  • znaczący spadek stężenia glukozy w ślinie badanych osób, szczególnie wyraźny spadek u osób z cukrzycą. Stężenie glukozy u diabetyków po zastosowaniu MPE™ było zbliżone do tego, które obserwujemy u osób zdrowych.
  • reakcja z MPE™ zachodzi do osiągnięcia pewnego minimalnego poziomu glukozy w ślinie, następnie reakcja blokowana jest prawdopodobnie przez specyficzne molekuły – inhibitory występujące w ślinie.

Dyskusja i wnioski

W wielu badaniach klinicznych zaobserwowano, że zęby pacjentów chorych na cukrzycę są w szczególnie wysokim stopniu narażone na próchnicę. Próchnica zębów powstaje w wyniku metabolizowania węglowodanów przez specyficzne dla jamy ustnej bakterie, takie jak np. Streptococcus mutans, Lactobacillus sp., do kwasu mlekowego, który powoduje obniżenie pH jamy ustnej i demineralizację tkanek twardych, co skutkuje powstaniem ubytku.

Ilość D-glukozy jako substratu wykorzystywanego przez bakterie w ślinie (w fizjologicznym stężeniu 50 μM) wynosi w przybliżeniu 0.047 nmol/min na 106 bakterii.

Zaawansowana próchnica zębów prowadzi do powikłań w obrębie miazgi zębowej, co może doprowadzić nawet do utraty zęba.

W tym badaniu udowodniono, że jest możliwe zmniejszenie ilości glukozy w ślinie ex-vivo u pacjentów chorych na cukrzycę. Dzięki zastosowaniu MPE w produktach do higieny jamy ustnej można kontrolować ilość glukozy w ślinie diabetyków, utrzymując stężenie glukozy zbliżone do tego występującego u osób zdrowych. Mimo, że niektórzy naukowcy nie są przekonani, że istnieje zależność pomiędzy występowaniem choroby cukrzycowej a wyższym ryzykiem wystąpienia próchnicy zębów, to nie można wykluczyć, że nadmiar stężenia glukozy z ślinie diabetyków (4-5 x wyższe niż u osoby zdrowej) jest czynnikiem ryzyka wystąpienia próchnicy zębów.

Nie można oczywiście zakładać, że obniżenie stężenia glukozy w ślinie diabetyków rozwiąże wszystkie problemy związane z jamą ustną, na jakie narażeni są chorzy na cukrzycę.

Jak już wcześniej wspomniano, diabetycy często zapadają na choroby dziąseł i przyzębia. Ból i krwawienie dziąseł, suchość w jamie ustnej, zmiany w obrębie błony śluzowej czy ruchomość zębów może świadczyć o chorobach przyzębia i błony śluzowej jamy ustnej. Choroby przyzębia możemy określić w najprostszy sposób jako przewlekłe zapalenie tkanek otaczających ząb, a więc dziąsła, ozębnej, cementu i kości wyrostka zębodołowego. Do patologii związanych z przyzębiem według klasyfikacji Amerykańskiej Akademii Periodontologicznej (AAP) z 2000 roku zaliczamy zarówno choroby dziąseł, jak i choroby przyzębia.  Największą grupę stanowią zapalenia dziąseł i przyzębia, które powstają na skutek zaburzenia równowagi pomiędzy oddziałującymi na tkanki przyzębia drobnoustrojami biofilmu, znajdującego się na powierzchni zębów i dziąseł a mechanizmami obronnymi gospodarza, które z kolei modyfikowane są przez czynniki ryzyka, takie jak nieprawidłowa higiena jamy ustnej, palenie tytoniu, stres, otyłość i cukrzyca. Wystąpienie choroby jest wypadkową oddziaływania wspomnianych czynników, a także czynnika genetycznego oraz fenotypu biologicznego. Czynnikiem inicjującym jednak całą reakcję immunologiczno-zapalną odpowiedzialną za destrukcję tkanek przyzębia są bakterie Gram-ujemne, takie jak Porphyromonas gingivalis (P.g), Trepanoma denticola (T.d), Tanerella forsythia (T.f) i Agregatibacter actinomycetemcomitans (A.a) Bakterie i toksyny pobudzają komórki immunologicznie kompetentne do wydzielania mediatorów zapalnych, takich jak PG2, TNF α, IL-1, MMP, oraz wolnych rodników tlenowych, te z kolei odpowiadają za stres oksydacyjny i miejscową destrukcję tkanek utrzymujących ząb, a więc tkanki łącznej i kostnej. Jednak rola mediatorów zapalnych, obecnych w kieszonkach przyzębnych wydaje się odgrywać znaczenie nie tylko miejscowe, ale także, w świetle współczesnych badań, może mieć udział lub stanowić czynnik ryzyka w powstawaniu choroby miażdżycowej, udaru mózgu, chorób sercowo-naczyniowych i cukrzycy.

W skład Kompleksu MPE™ wchodzą nie tylko proteiny, ale także witamina E i C, glicyna, kwas glutaminowy i cysteina jako prekursor glutationu, a także sam glutation –  działające silnie antyoksydacyjnie.

W składzie Anoxident balance® znajduje się dodatkowo wyciąg z roślin, który także neutralizuje wolne rodniki tlenowe, oraz apo-laktoferyna, mająca właściwości chelatowania jonów żelaza (dzięki czemu redukuje stężenie rodników wodorotlenowych).

Wszystkie wymienione składniki pełnią bardzo ważną rolę w neutralizowaniu wolnych rodników tlenowych odpowiedzialnych za stany zapalne dziąseł. W Kompleksie MPE® występują także składniki zdolne do kontrolowania rozwoju mikroorganizmów występujących w formie biofilmu lub formie planktonicznej, co może mieć znaczący wpływ na regenerację komórek błon śluzowych, uszkodzonych przez bakteryjne lipopolisacharydy.

Interesujące byłoby dalsze badanie in vivo u osób chorych z cukrzycą, dotyczące wielopoziomowego działania kompilacji składników preparatów Anoxident balance® na poszczególne procesy zachodzące w jamie ustnej oraz wpływu tych produktów na poprawę jakości życia pacjentów cukrzycowych.

Bibliografia

Dental caries in diabetic and prediabetic rats – Borghelli , R.F., Devoto, F.C., Foglia, V.G., Erausquin, J. 1966
J. Dent. Res, 45, 1105-1110

A tentative model for D-glucose turnover in human saliva – Cetik, S., Zhang, Y., Hupkens, E., Jurysta, C., Malaisse, W.J., Sener, A. 2013
Arch. Oral. Biol., 58 (10), 1265-1270

Experimental dental caries in the albino rats: The effect of single subcutaneous injections of alloxan on the incidence of dental caries – Hartles, R.L., Lawton, F.E., 1958
Br. J. Nutr., 12, 286-292

Clinical trials of caries inhibitory dentifrices – Kyes, F.M., Overton, N.J., McKean, T.W. 1961
J. Am. Dent. Assoc, 63, 189-193

Dental caries in type I Diabetics : Influence of systemic factors of the disease upon development of dental caries – Miralles, L., Silvestre, F.J., Hernandez-Mijares, A., Bautista, D., Llambes, F., Grau, D. 2006
Med. Oral Pathol. Oral Cir. Bucal: 11, E256-E260

Painful parotid hypertrophy with bulimia: a report of medical management – Park, K.K., Tung, R.C., Luzuriaga, A.B. 2009
J. Drugs. Dermatol, 8 (6), 577-579

Caries-risk assessment – Reich, E., Lussi, A., Newbrun, E. 1999
Int. Dent. J., 49, 15-26

Levels and location of adenosine 5’triphosphate in bovine milk – Richardson,T., McGann, T.C., and Kearney, R.D. 1980
J. Dairy. Res., 47 (1), 91-96

Diabetes, periodontal diseases, dental caries, and tooth loss: a review of the literature. – Taylor, G.W., Manz, M.C., Borgnakke, W.S. 2004
Compend. Contin. Educ. Dent., 25, 179-184, 186-178, 190, 192

Caries incidence in young type I diabetes mellitus patients in relation to metabolic control and caries-associated risk factors – Twetman, S., Johansson, I., Birkhed, D., Nederfors, T 2002
Caries Res. 36, 31-35